texto baseado neste video do eduardo castan
introdução ao NGS / sequênciamento de Segunda geração
O NGS são algumas tecnicas de sequênciamento desenvolvidas e englobadas por duas pricipais empresas, thermo-ficher e ilumina. Apesar de se divergerem na tecnologia e patêntes, ambas as tecnologias possuem o mesmo fluxo de trabalho/princípio de funcionamento.
Fluxo de trabalho de NGS
´´´ Preparo de biblioteca -> Amplificação -> Sequênciamento -> Análise ´´´
Geração de biblioteca
Essa é uma etapa comum aos sequênciamentos de ácidos núcleicos, etapa a qual é responsavel por preparar a amostra para que ela seja compatível a tecnologia.
Amplificação
As tecnologias necessitam amplificar os fragmentos de DNA para que o equipamento possa alcançar a sensibilidade necessária para a o sequênciamento
Sequênciamento
Está é a etapa a qual o equipamento consegue ler / destinguir as bases em sequência correta que estão no genoma
Analise
Está é a etapa de análise dos dados gerados pelo sequênciamento
preparo de biblioteca
Gerar fragmentos
Existem uma limitação na tecnica, ela não consegue sequenciar fragmetos muito grandes > 600pb. Apenas de 200-250pb. Por isso é necessário fragmentar esse genôme, com enzimas, sonicação ou pcr. Está pcr é uma super multiplex, que consegue pegar todos o genes
Adicionar adaptadores nas extremidades dos fragmentos
é adicionado um dna dupla fita nas extremidades dos fragmentos, e são ligados por DNAliagese
Adicionar marcadore de amostra
- thermofish = barcode
- ilumina = index
vem nos adaptadores, e são sequencias expecíficas que serve para separar as amostras mesmo fazendo uma reação em um tubo so.
Amplificação
Apartir desse momento as tecnologias de diferen em relação a amplificação da amostra
Ilumina
A tecnica de amplificação da ilumina é baseada em uma pcr em ponte uma forma de pcr a qual em um chip com uma região complementar aos adaptadores presentes no fragmento, assim fixando verticalmente o fragmento ao chip. Neste local é realizado a amplificação do alvo com a pcr e como há diversas dessas regiões complemntares espalhadas ao longo do chip, é criado uma ponte durante a amplificação, tornando possível a detecção de florecencia de nucleotídeos adaptados para emitir uma florecencia expecífica ao passo que a pcr avança, permitindo assim ao sequênciamento pois a tecnologia da ilumina se baseaia na emissão de um sinal de florecência. com este método é possivel gerar um sinal forte o suficiente para ser detectável
O fragmento de dna fica com o formato de ponte pois na superfície há primeres complementares ás sequências dos adaptadores, adicionados na parte de construção de bibliotecas com o primer ligado ao fragmento, durante os ciculos de pcrs, serão gerados novos fragmentos presos por pontes, as quais serão quebradas as ligações entre os primeres para ser aplificadas novamente, aumentando a superfície de florecência gerando assim clusteres de fragmentos.
Sequênciamento
Na tecnolgia da ilumina, devido o processo da pcr em ponte, é gerado fragmentos no sentido 5' -> 3' e 3' -> 5', os quais são sequenciados, porém um sentido de fita de cada vez. Uma vez que temos os clusters é adicionados os nucleotídeos especiais, eles possuem um floróro com as cores das bases, semelhante ao sequenciamento de primeria geração, os quais eles florecem dentro dos clusteres e param a plimerização pela enzima Uma vez que a florecência é detectada, o bloqueio e a florecencia da base complementar a fita sequênciada é excluida da reação, possibilidando assim a adição de uma nova base e continuando a adição de nucleotídeos e sequenciando todo o fragmento.
Amplificação Ion Torrent
A tecnologia de amplificação da thermo fisher é baseada em também uma pcr porém uma pcr em emulção esta pcr separa os fragmentos por missela. ou seja a ideia é separar apenas um fragmento e coloca-lo dentro de uma missela, junto com todos os materiasi necessários para sua amplificação. Em tubo com milhoes de misselas, dentro de cada uma o fragmento será amplificado preso a uma bead uma bolinha a qual têm centenas de primeres presos na sua superfície.
Seqênciamento Ion Torrent
Todas essas beads serão inseridas em um chip com 11 milhões de poços, os quais so cabem uma bead por poço. O sinal detectado pela maquina é a variação de Ph que é criado quando um nucleotídeo é incorporado pela dna polimeraze, sempre que acontece essa incorporação é liberado uma molécula de pirofostato e um atomo de hideogenio. o quê é detectável pela maquina. Isso é possivel pois a maquina consegue tira e botar um nucleotídeo por vez
