Sequênciamento de RNA
O sequênciamento de RNA é uma das melhores técnicas de análise de trascriptoma, junto com single-cell, superaram as limitações dos microarrays. Ela é baseada em um processo de conversão e preparo de biblioteca para os transcritos de RNA se transformarem em cDNA, assim possibilitando o encaixe nas tecnicas de sequenciamento, com NGS.
Extração e Filtragem do RNA
Este passo é essencial para se obter a amostra de RNA, é possível a extração por diversos métodos e assim como a filtração o objetivo é enrriquecer a amostra, ou já na extração com um kit de extração alvo expecífico, como mirvana para microRNAs, ou Fenol-cloroformio para RNA total, ou beads magnéticas.
É comum que a extração seja feita com 2 kits, um que extraia RNA total e outro que extraia apenas os alvos os quais sejam de interrese para sua pergunta biológica. Por exemplo, a maioria dos RNAs presentes em uma amostra são rRNAs(RNAs ribossomais) os quais talvez não sejam tão úteis dependendo da sua pergunta. Então é aplicado um kit que é capaz de remover este tipo de RNA, como um baseado em beads magnéticas.
Fragmentação
A maioria dos laboratórios possue o sequenciamento baseado em tecnologias da segunda geração (NGS). As quais é necessário a fragmentação do alvos para que seja possível a análise, normalmente entre 200-250bp. Isto pode ser feito com uma RNAase ou sonicação, assim gerando fragmentos compatíveis a tecnologia.
Controle de qualidade da Fragmentação
É necessário o controle de qualidade da fragmentação pois caso isso for perdido, os fragmentos de interrese não poderão ser sequenciados, assim perdendo o propósito da análise. Dois principais métodos são aplicados para este fim, como a flororímeria e PCR por capilar. PCR a qual é semelhante ao mecanismo explicado no sequenciamento Sanguer, cujo é feito a análise de onde estão os maiores porções dos fragmentos da amostra.
Preparo da Biblíoteca
As bibliotecas de Transcriptoma tem que ser convertidas em cDNA para serem compatíveis com a tecnologia, devem ter o sentido da fita conservado 5' -> 3' e 3' -> 5', pois é interresante para a análise. Assim como um indentificador de amostra, porém esse indentificador pode ou não ser feito nesta etapa, pois o preparo da biblioteca para o sequenciamento de DNA (Sanger,NGS, Nanopore e PacBio), também possue a etapa de indentificação de amostra.
Para a conservação do sentido da fita de RNA é adicionado dois fragmentos de DNAds com sequencias conhecidas as pontas do fragmento, assim é possível saber o sentido pois digamos que a sequencia AATCCG corresponde sempre ao sentido 5' e GGAAC sempre corresponde ao sentido 3', Dependendo da ordem a qual o fragmento é sequenciado, é possível a indentificação no inicio da fita. Estes fragmentos são adicionados e grudados com uma ligase.
- O quê é feito para que os fragmentos indentificadores de sentido não se grudem em ambas as extremidades da fita ?
Além disso, para a conversão de RNA em cDNA, nesse fragmentos é adicionado outra fita complementar a sequencia dos indentificadores, os quais se pareiam ma parte inical e final dos indentificadores, assim impedinfo que os mesmos fragmentos indentificadores se grudem na mesma fita, criando um indentificador 3' -> 3'. Os primeres são randômicos , portanto são capases de converter qualquer sequencia de RNA em cDNA.
Sequenciamento
O sequênciamento é geralmente feito por NGS, porém é possível por outros métodos. Em relação ao NGS, é necessário seguir todos os passos necessários para o encaixe á tecnologia.
Análise
