Sequênciamento de terceira geração / Nanopore
O sequênciamento baseado em Nanoporos é um tipo de sequênciamento o qual um ácido nucléico passa por uma proteina acoplada em uma membrana a qual no seu lado exteior(cis) possui uma diferênça de amperagem com o lado interior do poro(Trans), assim sendo possivel de diferênciar o potencial eletrico de cada nucleotideo passado pelo poro, através de um algoritimo que consegue destiguir-los com uma média de diferença de amperagem média entre os 5 nucleotidos passados pelo poro.
Fluxo de Trabalho
Bliblioteca -> sequenciamento -> AnálisePreparo de Biblioteca
Para o preparo da biblioteca para o sequênciamento de Nanopore é nescessario adicionar um herpin no fragmento de ssDNA. assim ligando as duas fitas, possibilitando assim a diferenciação de leitura da fita 5' -> 3' tal como a fita 3' -> 5', tendo assim uma redundância na leitura e melhorando a precisão.
Fragmento de identidicação para leitura
Esse fragmento de DNA é adicionado a extremidade oposta ao lado com herpin, e sua função é como calibrador de leitura, e possui complementariadade a um primer alocado ao poro, assim aumentando a afinidade e eficiência da leitura. Após este fragmento é adicionado outro com um Barcode, o qual pode é possível indentidicar amostras.
Adição da DNA polimerase
É necessário adicionar uma enzima que diminua a velocidade de passagem do DNA do lado cis para o lado trans. E a abertura da dupla fita a qual possibilida a leitura.
Diferenças entre NGS
- equipamento pequeno
- Não precisa amplificar