Sequênciamento de terceira geração PacBIO

A tecnologia da pacbio se baseia em SMRT (Single-Molecule Real Time) no qual é possiível observar a adição de nucleotideos em tempo real, pois é usado uma enzima modificada com alta afinidade por nucleotídeos floróforos, toda vez que um nucleotídeo é adicionado a fita complementar é emitido luz do floróforo expecífico. Tal como todos os tipos de sequênciamento de terceira geração, suas vantagems é sequênciar fragmentos longos e não necessita a etapa de amplificação por PCR

Preparo de biblioteca

está enzima fica presa a um poço, chamdos de ZMW (Zero-Mode Waveguide Detector). Este detector é fundamental pois é a menor estrutura passível de suportar volume já criada, e isso é fundamental para o funcionamento da tecnologia, a detecção de volume é de 1 zeptolitro, ou um trilionesimo e milesimo de litro. Na superfície do leitor, junto com o fragmento alvo, fragmento este que tem a biblioteca de preparo circularizado o que aumenta a eficiência da codificação, assim com ambas os sentidos das fitas de dna sendo sequênciadas. além desta circularização é adicionado um barcode para poder se possível indentificar a amostra.

Sequênciamento

Há emissão de luz do fundo pra cima do poço, mas por conta dos ZWMs tere uma capacidade de volue muito pequena a luz emitida não chega ao topo do poço, apenas ficando mais intença ao fundo dele. Dentro da reação há, o fragmento preparado, a enzima que é forçada a ficar no fundo do poço e os floróros modificados, eles possuem 5 fosfatos. quando a luz é emitida e só possível de detectar no fundo do poço.

Existe um ruido de luz, uma florecência basal de todos os nucleotídeos (bases as quais têm cores diferentes, relativa a cada base). Mas quando a DNA polimeraze recruta a nucleotídeo molde para a fita complementar, sua fluorecência é detectada por mais tempo permitindo assim um pico no gráfico da detecção de florecência, e assim distinguindo cada base em ordem

Taxa de erro

A tecnologia da PacBio possue uma alta taxa de erro, cerca de 5 a cada 100, ou 5%, isso é devido a alta velocidade de polimerização da enzima, a mesma faz cerca de mil pares de bases por segundo e o detector não consegue diferênciar todos os floróforos associados a cada nucleotídeo. Porém, esses erros não vêm da característica do fragmento, mas sim da tecnica. Ou seja, para fragmentos difíceis de sequênciar a tecnologia da PacBio é mais interresante, já que os erros são aleatórios, basta sequênciar o fragmento várias vezes para se ter uma boa precisão. Mesmo para regiôes difíceis de sequênciar como telômeros e centrômeros. Por isso que no preparo da biblioteca é adicionado adaptadores a fim de circularizar o fragmento, para que em várias rodadas cubram os floróforos associados as bases os quais não foram diferenciados nas rodadas se sequênciamento anteriores. Aumentando assim a eficácia de 99%. Entretanto, para que isso ocorra é necessário diminuir o tamanho do fragmento